無(wú)熒光性新型SHG成像用染料

Ap3, SHG成像染料

Ap3是一種無(wú)熒光性SHG染料，在SHG信號(hào)成像中不會(huì)發(fā)出障礙性熒光。它與常規(guī)的熒光性膜染色染料不同，可以只觀察細(xì)胞膜的信號(hào)，因此能夠用于分析細(xì)胞膜的準(zhǔn)確位置。另外，由于SHG信號(hào)強(qiáng)度和膜電位相關(guān)，因此還能用于膜電位的成像。

※ 本產(chǎn)品僅供科研用，不可作其他用途。

※ 本產(chǎn)品基于慶應(yīng)義塾大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教室以及筑波大學(xué) 數(shù)理物質(zhì)系（學(xué)際物質(zhì)科學(xué)研究中心）的研究成果，由funakoshi進(jìn)行商品化并銷售。

※ Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

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使用SHG專用染料對(duì)細(xì)胞膜現(xiàn)象進(jìn)行成像

利用雙光子現(xiàn)象之二次諧波產(chǎn)生（Second Harmonic Generation: SHG）

在顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞膜形態(tài)和變化

慶應(yīng)義塾大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教室 塗谷睦生 老師

【背景】

細(xì)胞膜分隔細(xì)胞內(nèi)外，可以作為在其周邊產(chǎn)生的電信號(hào)和化學(xué)信息的傳遞場(chǎng)所，因此在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞中起著十分重要的作用。但是，由于其結(jié)構(gòu)的精細(xì)和復(fù)雜性等，難以進(jìn)行生理學(xué)上的分析。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞膜具有高親和力的染料在細(xì)胞膜中會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的SHG信號(hào)，由于該信號(hào)會(huì)根據(jù)膜電位而變化，因此研究認(rèn)為，SHG成像在細(xì)胞膜的標(biāo)記及其電位變化的分析等方面非常有效。

【無(wú)熒光性SHG專用染料Ap3】

Ap3是為了SHG成像而開發(fā)和合成的一種新型的無(wú)熒光性SHG專用染料，使用這種染料可實(shí)現(xiàn)觀察其他熒光染料的同時(shí)觀測(cè)。利用這一點(diǎn)，使用Ap3進(jìn)行SHG成像可以觀察到響應(yīng)神經(jīng)活動(dòng)引起的膜電位變化，同時(shí)通過(guò)鈣敏感性染料的熒光成像，還可以觀察到膜附近鈣濃度的變化。研究表明，使用Ap3進(jìn)行的成像，由于光照射引起的信號(hào)衰減和細(xì)胞毒性非常低。因此利用Ap3能夠可視化細(xì)胞膜，捕捉膜電位的變化，還可能同時(shí)對(duì)熒光蛋白的動(dòng)態(tài)和報(bào)告熒光染料的信號(hào)變化進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像。因而使用Ap3對(duì)腦細(xì)胞、包括肌細(xì)胞在內(nèi)的其他興奮性細(xì)胞的生理學(xué)分析，或使用各種系統(tǒng)的離子通道的功能分析等的應(yīng)用方面?zhèn)涫芷诖?/span>

【展望】

除上述以外，SHG成像還可以對(duì)細(xì)胞膜的損傷和脂質(zhì)成分，以及核酸或蛋白等生物分子的結(jié)構(gòu)變化等多種生命現(xiàn)象進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。利用具有這種特殊能力的普通多光子顯微鏡系統(tǒng)，即可輕松地進(jìn)行SHG成像，而且通過(guò)擴(kuò)展專用染料的應(yīng)用性，相信SHG成像作為生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的新型工具會(huì)有更進(jìn)一步的發(fā)展。

◆特點(diǎn)

●　Ap3是SHG成像的專用染料。除 SHG信號(hào)外，不會(huì)發(fā)出熒光

●　Ap3無(wú)熒光性， SHG成像的同時(shí)還能進(jìn)行鈣成像等熒光性成像的多模式成像

●　Ap3是一種光穩(wěn)定性高的化合物

●　Ap3具有極低的光毒性，對(duì)細(xì)胞的損傷小

●　推薦光源：鈦藍(lán)寶石激光（波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)：950 nm）

※ 在SHG成像中，需要雙光子激發(fā)顯微鏡、SHG信號(hào)用濾光片（例如465-485 nm的帶通濾光片）

※ 在SHG成像的觀察中，物鏡的另一側(cè)（正置顯微鏡時(shí)為下方）需要檢測(cè)系統(tǒng)。另外，在檢測(cè)系統(tǒng)一側(cè)建議使用具有光電倍增管（PMT）的顯微鏡。

◆操作方法要點(diǎn)

1. 在玻璃底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞；

2. 向細(xì)胞中添加終濃度為20 μM的Ap3溶液；

3. 使用雙光子激發(fā)顯微鏡進(jìn)行觀察。

◆應(yīng)用實(shí)例1

■　Ap3的SHG信號(hào)和無(wú)熒光性

950 nm激光照射時(shí)，通過(guò)Ap3可觀察到 SHG 信號(hào)，但未觀察到熒光信號(hào)。

■　腦切片中SHG成像的膜電位變化

A：電壓固定時(shí)SHG信號(hào)的膜電位敏感性

B：動(dòng)作電位依賴性SHG信號(hào)變化（左）和通過(guò)膜片鉗測(cè)量的電位變化（右）

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

■　同時(shí)測(cè)量腦切片中SHG成像的膜電位變化和熒光成像的鈣濃度

在腦切片中反復(fù)施加動(dòng)作電位時(shí)（左；比例尺20 mV，5 s），觀察Ap3的SHG信號(hào)和熒光性鈣檢測(cè)試劑Rhod-2的雙光子熒光信號(hào)（TPF）（右）。在成像中同時(shí)測(cè)量的膜電位變化和鈣濃度變化。

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

◆應(yīng)用實(shí)例2

■　比較多模式雙光子顯微鏡下的細(xì)胞膜選擇性SHG成像和細(xì)胞膜熒光成像

用Ap3對(duì)表達(dá)細(xì)胞膜觀察用膜錨定GFP的細(xì)胞進(jìn)行染色，同時(shí)可視化在950 nm飛秒激光照射下GFP的雙光子熒光（TPF，綠色）和Ap3的SHG（洋紅色）信號(hào)。

由于GFP信號(hào)不僅從細(xì)胞膜，還會(huì)從囊泡等許多細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)中發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，因此難以準(zhǔn)確地識(shí)別出細(xì)胞膜的位置。與之相對(duì)的，Ap3的 SHG 信號(hào)只能從細(xì)胞膜發(fā)出，從而可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的選擇性成像和位點(diǎn)的準(zhǔn)確識(shí)別。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下細(xì)胞膜正下方的囊泡動(dòng)態(tài)和肌動(dòng)蛋白

在表達(dá)GFP標(biāo)記肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞中，分別用紅色熒光標(biāo)記Dextran染色胞吞后的囊泡，用Ap3染色細(xì)胞膜，同時(shí)利用多模式雙光子顯微鏡進(jìn)行可視化。

Ap3的SHG信號(hào)具有細(xì)胞膜特異性，而且可以與熒光信號(hào)分離，因此能夠通過(guò)Ap3的SHG信號(hào)準(zhǔn)確識(shí)別細(xì)胞膜的位置，從而準(zhǔn)確地測(cè)量從細(xì)胞膜到肌動(dòng)蛋白骨架的距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下質(zhì)膜正下方的囊泡動(dòng)態(tài)和微管蛋白

在經(jīng)過(guò)微管蛋白可視化試劑染色的細(xì)胞中，分別用紅色熒光標(biāo)記Dextran標(biāo)記胞吞后的囊泡，用Ap3標(biāo)記細(xì)胞膜，利用多模式雙光子顯微鏡進(jìn)行可視化。

Ap3的SHG信號(hào)具有細(xì)胞膜特異性，而且可以與熒光信號(hào)分離，因此能夠通過(guò)Ap3的SHG信號(hào)準(zhǔn)確識(shí)別細(xì)胞膜的位置，而且可以測(cè)量從細(xì)胞膜到微管，以及細(xì)胞膜正下方囊泡移動(dòng)的準(zhǔn)確距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

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